Pureza do peptídeo: o que significa "99 %" HPLC num certificado, e o que não significa

HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) separa os componentes de uma amostra ao fazer passar uma solução através de uma coluna empacotada sob pressão.

Em fase inversa HPLC, o padrão para peptídeos, o enchimento da coluna é não polar (normalmente cadeias C18 ligadas à sílica) e a fase móvel é água com uma proporção crescente de acetonitrilo, geralmente com 0,1 % de ácido trifluoroacético.

Os componentes saem da coluna em tempos diferentes consoante a força com que aderem ao enchimento: mais hidrofóbicos, mais tarde.

Na saída, um detetor UV regista a absorbância em função do tempo. Os peptídeos absorvem a 214–220 nm devido às suas ligações peptídicas, sendo esse o comprimento de onda utilizado.

O registo é o cromatograma: uma linha de base com picos, cada pico correspondendo a um componente, a sua área proporcional à quantidade desse componente que passou pelo detetor.

Para aprofundar: Peptídeos liofilizados.

O valor de pureza é uma razão de áreas:

pureza (%) = área do pico principal ÷ soma das áreas de todos os picos × 100

Se o pico principal representa 99,2 % da área total integrada, o certificado indica 99,2 %.

Todo o restante no traço (os 0,8 %) são picos de impureza: outras moléculas que absorvem no mesmo comprimento de onda e eluíram noutros tempos.

O valor desse número depende da sua origem: um laboratório independente nomeado, um número de tarefa e uma chave que se confirmam no site do laboratório, e o composto nomeado no mesmo relatório, com a quantidade em mg.

Uma percentagem impressa isoladamente, sem nada disto, é uma afirmação, não uma medição.

Alguns laboratórios juntam o traço, a coluna e o gradiente; o capítulo geral da USP sobre cromatografia descreve o que um método reportável inclui. Como ler o restante do documento encontra-se em como ler um COA de peptídeo.

Afirma: do material que absorve UV que saiu da coluna, 99 % eluiu como um único pico. A amostra é cromatograficamente limpa.

Não afirma:

• Que o frasco contém 99 mg de peptídeo por 100 mg de pó. O peptídeo liofilizado nunca é peptídeo puro em massa. Contém água residual (alguns por cento), contra-íones resultantes da purificação (acetato ou trifluoroacetato ligados aos resíduos básicos) e por vezes sais. Nenhum destes absorve a 220 nm, pelo que não aparecem no cromatograma. A fração mássica de peptídeo real é uma medição separada chamada conteúdo líquido de peptídeo, obtida por análise de aminoácidos ou análise elementar (azoto), situando-se habitualmente entre 70 e 90 % nos peptídeos liofilizados. Um valor HPLC de 99 % e um conteúdo líquido de peptídeo de 80 % descrevem o mesmo frasco sem contradição.
• Que o pico principal é o composto indicado no rótulo. Uma sequência errada, bem purificada, também produz um único pico limpo. A identidade é uma questão diferente, respondida por um relatório de laboratório independente que nomeia o composto encontrado, dá a quantidade medida em mg e a pureza em %, com número de tarefa e chave verificável no site do laboratório; a espectrometria de massa pode ser oferecida por alguns laboratórios como opção adicional.
• Qualquer coisa sobre o lote que possui, a menos que o certificado contenha o número desse lote.

Para aprofundar: retatrutida com relatório por tamanho.

A espectrometria de massa pesa a molécula.

A amostra é ionizada (electrospray, ESI, ou MALDI) e o instrumento indica a razão massa-carga dos iões; a partir dela o laboratório calcula a massa molecular observada e compara-a com a massa teórica do composto.

Para GHK-Cu a massa esperada é cerca de 404 Da; para BPC-157, cerca de 1 419 Da.

A concordância dentro de uma fração de dalton confirma que o pico HPLC principal é o peptídeo indicado no rótulo. É um teste que alguns laboratórios fornecem como opção.

Sem ele, a identidade vem do próprio laboratório, que nomeia o composto encontrado num teste cego e indica a quantidade em mg e a pureza em %, com número de tarefa verificável.

HPLC sem identificação fornece a pureza de uma substância não nomeada; um relatório independente que nomeia o composto, dá a quantidade medida em mg e a pureza em %, com número de tarefa e chave verificável no site do laboratório, fornece ambos.

Um certificado de análise contém estas informações da mesma amostra, no mesmo relatório.

Os pequenos picos em torno do principal não são misteriosos. A síntese de peptídeos em fase sólida e o manuseamento posterior produzem um conjunto previsível de subprodutos, cada um com um nome químico:

• Sequências truncadas. Um resíduo falhou na acoplagem durante a síntese, pelo que uma fração das cadeias carece de um aminoácido (sequências de deleção). Eluem perto do pico principal e são a impureza mais comum.
• Cadeias incompletamente desprotegidas. Um grupo protetor da síntese (t-butilo, trityl) permaneceu ligado. Ligeiramente mais hidrofóbico: elui mais tarde.
• Desamidação. Uma cadeia lateral de asparagina ou glutamina converteu-se num ácido carboxílico. Um dalton mais pesada; frequentemente visível como um ombro no pico principal.
• Oxidação de metionina. O enxofre de um resíduo de metionina captou um oxigénio (metionina sulfóxido, +16 Da). Elui mais cedo.
• Formação de aspartimida e racemização. Rearranjos em resíduos de aspartato durante a síntese; minoritários, mas característicos.
• Dímeros e agregados. Duas cadeias ligadas, normalmente através de cisteína; eluição muito mais tardia e massa duplicada na EM.

Um laboratório que identifica estes picos por nome, ou pelo menos por tempo de retenção e área, está a mostrar a sua integração. Um que apresenta apenas um número não o faz.

A frase aparece em milhares de listagens. Lida literalmente é uma especificação ("pretendemos pelo menos 98 %") não uma medição de qualquer lote.

Sem relatório independente com nome do composto, quantidade em mg, pureza em %, número de tarefa e chave verificável, não pode ser verificada, e um valor que não pode ser verificado tem o mesmo conteúdo informativo que nenhum valor.

O mesmo se aplica a percentagens sem casa decimal em todos os produtos de um fornecedor.

Valores medidos surgem como 98,7 % ou 99,31 %; um catálogo em que todos os itens indicam "99 %" foi digitado, não testado.

As verificações de fornecedores que decorrem disto encontram-se em como verificar um fornecedor de peptídeos.

Um caso em que o nome do composto, e não a percentagem, constitui toda a verificação de identidade é analisado em GHK-Cu vs AHK-Cu, dois compostos separados por 14 Da.

Para aprofundar: retatrutida portugal.

O que pedir a qualquer fornecedor para um único composto (tamanhos, pureza, campos de um relatório) explica-se em o guia de compra de BPC-157.