Pureza do peptídeo: o que significa "99 %" HPLC num certificado — e o que não significa

HPLC — cromatografia líquida de alta eficiência — separa os componentes de uma amostra ao fazer passar uma solução através de uma coluna empacotada sob pressão.

Em HPLC de fase inversa, o método padrão para peptídeos, o enchimento da coluna é não polar (normalmente cadeias C18 ligadas à sílica) e a fase móvel é água com proporção crescente de acetonitrilo, geralmente com 0,1 % de ácido trifluoroacético.

Os componentes saem da coluna em tempos diferentes consoante a força com que aderem ao enchimento: mais hidrofóbicos, mais tarde.

Na saída, um detetor UV regista a absorbância em função do tempo. Os peptídeos absorvem a 214–220 nm devido às ligações peptídicas, sendo esse o comprimento de onda utilizado.

O registo é o cromatograma: uma linha de base com picos, cada pico correspondendo a um componente, a sua área proporcional à quantidade desse componente que passou pelo detetor.

O valor de pureza é uma razão de áreas:

pureza (%) = área do pico principal ÷ soma das áreas de todos os picos × 100

Se o pico principal representa 99,2 % da área total integrada, o certificado indica 99,2 %.

Todo o restante no traço — os 0,8 % — são picos de impureza: outras moléculas que absorvem no mesmo comprimento de onda e eluíram noutros tempos.

Três detalhes determinam se esse número tem valor: o laboratório indicou o método (coluna, gradiente, comprimento de onda), o cromatograma é apresentado com os seus eixos e a integração é visível — quais os picos contados.

Uma percentagem impressa isoladamente, sem traço, é uma afirmação, não uma medição.

O capítulo geral da USP sobre cromatografia descreve o que um método reportável inclui; um certificado rigoroso segue-o. Como ler o restante do documento encontra-se em como ler um COA de peptídeo.

Afirma: do material que absorve UV que saiu da coluna, 99 % eluiu como um único pico. A amostra é cromatograficamente limpa.

Não afirma:

• Que o frasco contém 99 mg de peptídeo por 100 mg de pó. O peptídeo liofilizado nunca é peptídeo puro em massa. Contém água residual (alguns por cento), contra-íones resultantes da purificação — acetato ou trifluoroacetato ligados aos resíduos básicos — e por vezes sais. Nenhum destes absorve a 220 nm, pelo que não aparecem no cromatograma. A fração mássica de peptídeo real é uma medição separada chamada conteúdo líquido de peptídeo, obtida por análise de aminoácidos ou análise elementar (azoto), situando-se habitualmente entre 70 e 90 % nos peptídeos liofilizados. Um valor HPLC de 99 % e um conteúdo líquido de peptídeo de 80 % descrevem o mesmo frasco sem contradição.
• Que o pico principal é o composto indicado no rótulo. Uma sequência errada, bem purificada, também produz um único pico limpo. A identidade é uma questão diferente, respondida por espectrometria de massa.
• Qualquer coisa sobre o lote que possui, a menos que o certificado inclua o número desse lote.

A espectrometria de massa pesa a molécula.

A amostra é ionizada (electrospray, ESI, ou MALDI) e o instrumento indica a razão massa-carga dos iões; a partir dela o laboratório calcula a massa molecular observada e compara-a com a massa teórica do composto.

Para GHK‑Cu a massa esperada é cerca de 404 Da; para BPC‑157, cerca de 1 419 Da. A concordância dentro de uma fração de dalton confirma que o pico HPLC principal é o peptídeo indicado no rótulo.

HPLC sem EM fornece a pureza de uma substância não identificada; EM sem HPLC fornece a identidade sem valor de pureza. Um certificado de análise contém ambas as linhas, da mesma amostra, no mesmo relatório.

Os pequenos picos em torno do principal não são misteriosos. A síntese de peptídeos em fase sólida e o manuseamento posterior produzem um conjunto previsível de subprodutos, cada um com um nome químico:

• Sequências truncadas. Um resíduo falhou na acoplagem durante a síntese, pelo que uma fração das cadeias carece de um aminoácido (sequências de deleção). Eluem perto do pico principal e são a impureza mais comum.
• Cadeias incompletamente desprotegidas. Um grupo protetor da síntese (t-butilo, trityl) permaneceu ligado. Ligeiramente mais hidrofóbico: elui mais tarde.
• Desamidação. Uma cadeia lateral de asparagina ou glutamina converteu-se num ácido carboxílico. Um dalton mais pesada; frequentemente visível como um ombro no pico principal.
• Oxidação de metionina. O enxofre de um resíduo de metionina captou um oxigénio (metionina sulfóxido, +16 Da). Elui mais cedo. O Semax contém metionina, razão pela qual é expedido selado e refrigerado.
• Formação de aspartimida e racemização. Rearranjos em resíduos de aspartato durante a síntese; minoritários, mas característicos.
• Dímeros e agregados. Duas cadeias ligadas, normalmente através de cisteína; eluição muito mais tardia e massa duplicada na EM.

Um laboratório que identifica estes picos por nome, ou pelo menos por tempo de retenção e área, está a mostrar a sua integração. Um que apresenta apenas um número não o faz.

A frase aparece em milhares de listagens. Lida literalmente é uma especificação — "pretendemos pelo menos 98 %" — não uma medição de qualquer lote.

Sem traço, método e número de lote, não pode ser verificada, e um valor que não pode ser verificado tem o mesmo conteúdo informativo que nenhum valor.

O mesmo se aplica a percentagens sem casa decimal em todos os produtos de um fornecedor.

Valores medidos surgem como 98,7 % ou 99,31 %; um catálogo em que todos os itens indicam "99 %" foi digitado, não testado.

As verificações de fornecedores que decorrem disto encontram-se em onde comprar peptídeos de investigação nos EUA.

Um caso em que a linha de massa, e não a percentagem, constitui toda a verificação de identidade é analisado em GHK‑Cu vs AHK‑Cu, dois compostos separados por 14 Da.

Um exemplo prático de certificado para um único composto — tamanhos, lote, o que o relatório mostra — encontra-se em o guia de compra de BPC‑157.