Peptīdu tīrība: ko "99 %" HPLC sertifikātā nozīmē — un ko tas nenozīmē

HPLC — augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija — atdala parauga komponentus, spiediena ietekmē virzot tā šķīdumu caur pildītu kolonnu.

Reversās fāzes HPLC, kas ir standarts peptīdiem, kolonnas pildījums ir nepolārs (parasti C18 ķēdes, saistītas ar silīcija dioksīdu), bet mobilā fāze ir ūdens ar pieaugošu acetonitrila īpatsvaru, parasti ar 0,1 % trifluoretiķskābes.

Komponenti iziet no kolonnas dažādos laikos atkarībā no tā, cik stipri tie pieķeras pildījumam: hidrofobākie — vēlāk.

Izejas vietā UV detektors reģistrē absorbciju pret laiku. Peptīdi absorbē pie 214–220 nm peptīdu saišu dēļ, tāpēc izmanto šo viļņa garumu.

Ieraksts ir hromatogramma: bāzes līnija ar pīķiem, katrs pīķis atbilst vienam komponentam, tā laukums proporcionāls tam, cik daudz šī komponenta izgāja caur detektoru.

Tīrības rādītājs ir laukumu attiecība:

tīrība (%) = galvenā pīķa laukums ÷ visu pīķu laukumu summa × 100

Ja galvenais pīķis veido 99,2 % no kopējā integrētā laukuma, sertifikātā norādīts 99,2 %. Viss pārējais hromatogrammā — 0,8 % — ir piemaisījumu pīķi: citas molekulas, kas absorbē pie tā paša viļņa garuma un izelūda citos laikos.

Trīs detaļas nosaka, vai šis skaitlis ir vērtīgs: laboratorija norādījusi metodi (kolonna, gradients, viļņa garums), hromatogramma parādīta ar asīm un integrācija ir redzama — kuri pīķi tika skaitīti.

Procentuālā vērtība, kas publicēta atsevišķi bez hromatogrammas, ir apgalvojums, nevis mērījums.

Vispārējā USP nodaļa par hromatogrāfiju apraksta, ko ietver ziņojama metode; nopietns sertifikāts to ievēro. Kā lasīt pārējo dokumentu, skatiet kā lasīt peptīdu COA.

Apgalvo: no UV absorbējošā materiāla, kas izgāja no kolonnas, 99 % izelūda kā viens pīķis. Paraugs ir hromatogrāfiski tīrs.

Neapgalvo:

• Ka flakonā ir 99 mg peptīda uz 100 mg pulvera. Liofilizēts peptīds nekad nav tīrs peptīds pēc masas. Tas satur atlikušo ūdeni (dažus procentus), pretjonus, kas palikuši pēc attīrīšanas — acetātu vai trifluorecetātu, saistītu ar bāziskajām atliekām — un dažreiz sāļus. Neviens no tiem neabsorbē pie 220 nm, tāpēc hromatogrammā neparādās. Peptīda masas daļa ir atsevišķs mērījums, ko sauc neto peptīdu saturs, iegūts ar aminoskābju analīzi vai elementāro (slāpekļa) analīzi, un liofilizētiem peptīdiem tas parasti ir starp 70 un 90 %. 99 % HPLC rādītājs un 80 % neto peptīdu saturs apraksta vienu un to pašu flakonu bez pretrunām.
• Ka galvenais pīķis ir savienojums uz etiķetes. Nepareiza secība, labi attīrīta, arī dod vienu tīru pīķi. Identitāte ir atsevišķs jautājums, uz kuru atbild masu spektrometrija.
• Neko par partiju, kas Jums ir, ja vien sertifikātā nav norādīts šīs partijas numurs.

Masu spektrometrija nosver molekulu.

Paraugs tiek jonizēts (elektrosprausla, ESI, vai MALDI), un instruments ziņo jonu masas-uz-lādiņa attiecību; no tās laboratorija aprēķina novēroto molekulāro masu un salīdzina to ar teorētisko savienojuma masu.

GHK‑Cu paredzamā masa ir aptuveni 404 Da; BPC‑157 — aptuveni 1,419 Da. Sakritība daļas daltona robežās apstiprina, ka galvenais HPLC pīķis ir peptīds, kas norādīts uz etiķetes.

HPLC bez MS dod neidentificētas vielas tīrību; MS bez HPLC dod identitāti bez tīrības rādītāja. Analīzes sertifikātā ir abas rindas no viena parauga vienā ziņojumā.

Mazie pīķi ap galveno nav noslēpumaini. Cietās fāzes peptīdu sintēze un turpmākā apstrāde rada paredzamu blakusproduktu kopu, un katram ir ķīmisks nosaukums:

• Truncētas sekvences. Viena atlieka sintēzes laikā nesavienojās, tāpēc daļa ķēžu trūkst vienas aminoskābes (dzēšanas sekvences). Tās izelūda tuvu galvenajam pīķim un ir visbiežākais piemaisījums.
• Nepilnīgi deprotektētas ķēdes. Aizsarggrupa no sintēzes (t-butila, tritiila) palika pievienota. Nedaudz hidrofobāka: izelūda vēlāk.
• Deamidācija. Asparagīna vai glutamīna sānu ķēdes amīds pārvērtās par karboksilskābi. Viena daltona smagāka; bieži redzama kā plecs uz galvenā pīķa.
• Metionīna oksidācija. Metionīna atliekas sērs pieņēma skābekli (metionīna sulfoksīds, +16 Da). Izelūda agrāk. Semax satur metionīnu, tāpēc tas tiek nosūtīts noslēgtā veidā un auksts.
• Aspartimīda veidošanās un racemizācija. Pārkārtojumi aspartāta atliekās sintēzes laikā; nelieli, bet raksturīgi.
• Dimēri un agregāti. Divas ķēdes saistītas, parasti caur cisteīnu; daudz vēlāka elūcija un dubultota masa MS.

Laboratorija, kas ziņo šos pīķus pēc nosaukuma vai vismaz pēc aiztures laika un laukuma, parāda savu integrāciju. Tā, kas rāda tikai vienu skaitli, to nedara.

Frāze parādās tūkstošiem sarakstu. Burtiski lasot tā ir specifikācija — "mēs plānojam vismaz 98 %" — nevis jebkuras partijas mērījums.

Bez hromatogrammas, metodes un partijas numura to nevar pārbaudīt, un skaitli, ko nevar pārbaudīt, ir tāds pats informācijas saturs kā bez skaitļa.

Tas pats attiecas uz procentuālām vērtībām bez decimāldaļas uz katra piegādātāja produkta. Mērītās vērtības iznāk kā 98,7 % vai 99,31 %; katalogs, kurā katrs ieraksts lasāms "99 %", ir rakstīts, nevis testēts.

Piegādātāju pārbaudes, kas izriet no tā, atrodamas kur iegādāties pētniecības peptīdus ASV.

Gadījums, kurā masas līnija, nevis procentuālā vērtība, ir visa identitātes pārbaude, ir izskatīts GHK‑Cu vs AHK‑Cu, divi savienojumi, kas atšķiras par 14 Da.

Strādājošs sertifikāta piemērs vienam savienojumam — izmēri, partija, ko parāda ziņojums — atrodams BPC‑157 iegādes ceļvedī.