Peptid tisztaság: mit jelent a „99 %” HPLC egy tanúsítványon — és mit nem

HPLC — nagy teljesítményű folyadékkromatográfia — a minta komponenseit úgy választja szét, hogy oldatát nyomás alatt töltött oszlopon átnyomja.

Fordított fázisú HPLC-ben, ami a peptidek szabványa, az oszloptöltet nem poláris (általában szilícium-dioxidhoz kötött C18 láncok), a mobil fázis pedig víz, növekvő acetonitril-arányban, általában 0,1 % trifluorecetsavval.

A komponensek eltérő időpontokban hagyják el az oszlopot attól függően, mennyire kötődnek erősen a töltethez: a hidrofóbabbak később.

A kimenetnél UV-detektor rögzíti az abszorbancia-idő függvényt.

A peptidek 214–220 nm-en nyelnek el a peptidkötések miatt, ezért ezt a hullámhosszt használják.

A felvétel a kromatogram: alapvonal csúcsokkal, minden csúcs egy komponens, területe arányos azzal, mennyi komponens haladt át a detektoron.

A tisztasági érték területek aránya:

tisztaság (%) = főcsúcs területe ÷ összes csúcs területének összege × 100

Ha a főcsúcs az integrált terület 99,2 %-át adja, a tanúsítvány 99,2 %-ot mutat. A görbén lévő többi rész — a 0,8 % — szennyező csúcsok: más, ugyanazon a hullámhosszon elnyelő molekulák, amelyek más időpontban eluálódtak.

Három részlet határozza meg, hogy a szám ér-e valamit: a laboratórium megadta-e a módszert (oszlop, gradiens, hullámhossz), látható-e a kromatogram tengelyekkel, és látható-e az integráció — mely csúcsokat számolták.

Egy önmagában, nyom nélkül kiírt százalék állítás, nem mérés.

Az USP kromatográfiáról szóló általános fejezete leírja, mit tartalmaz egy jelenthető módszer; egy komoly tanúsítvány ezt követi. A dokumentum többi részének olvasásáról a hogyan olvassunk peptid COA-t című bejegyzésben olvasható.

Azt mondja: az oszlopról lemosott UV-elnyelő anyag 99 %-a egyetlen csúcsként eluálódott. A minta kromatográfiailag tiszta.

Azt nem mondja:

• Hogy a fiola 100 mg poronként 99 mg peptidet tartalmaz. A liofilizált peptid tömeg szerint soha nem tiszta peptid. Maradék vizet (néhány százalék), a tisztításból visszamaradt ellenionokat — acetátot vagy trifluoracetátot, a bázikus maradékokhoz kötve — és néha sókat tartalmaz. Ezek egyike sem nyel el 220 nm-en, ezért egyik sem jelenik meg a kromatogramon. A tényleges peptid tömegaránya külön mérés, nettó peptidtartalom, aminosav-analízissel vagy elemanalízissel (nitrogén) határozzák meg, és liofilizált peptideknél általában 70–90 % között van. A 99 % HPLC-érték és a 80 % nettó peptidtartalom ugyanazt a fiolát írja le ellentmondás nélkül.
• Hogy a főcsúcs a címkén szereplő vegyület. Egy hibás szekvencia, ha jól tisztították, szintén egyetlen tiszta csúcsot ad. Az azonosság más kérdés, amelyet tömegspektrometria válaszol meg.
• Valamit a birtokolt lotról, hacsak a tanúsítvány nem tartalmazza az adott lot számát.

A tömegspektrometria megméri a molekula tömegét.

A mintát ionizálják (elektrospray, ESI vagy MALDI), a műszer pedig az ionok tömeg-töltés arányát adja meg; ebből a laboratórium kiszámítja a megfigyelt molekulatömeget és összeveti a vegyület elméleti tömegével.

A GHK‑Cu esetében a várt tömeg körülbelül 404 Da; a BPC‑157 esetében körülbelül 1 419 Da. A dalton törtrészén belüli egyezés igazolja, hogy a fő HPLC-csúcs a címkén szereplő peptid.

HPLC MS nélkül egy azonosítatlan anyag tisztaságát adja; MS HPLC nélkül azonosságot ad tisztasági érték nélkül. A vizsgálati tanúsítvány mindkét sort tartalmazza, ugyanabból a mintából, ugyanazon a jelentésen.

A fő csúcs körüli kis csúcsok nem rejtélyesek. A szilárd fázisú peptidszintézis és az azt követő feldolgozás kiszámítható melléktermék-készletet hoz létre, és mindegyiknek van kémiai neve:

• Truncated sequences. A szintézis során egy maradék nem kapcsolt, így a láncok egy része hiányzik egy aminosavval (deléciós szekvenciák). Közel a fő csúcshoz eluálódnak, és a leggyakoribb szennyezők.
• Incompletely deprotected chains. A szintézisből származó védőcsoport (t-butil, trityl) maradt kapcsolva. Kissé hidrofóbabb: később eluálódik.
• Deamidation. Egy aszparagin vagy glutamin oldallánc-amid karbonsavvá alakult. Egy daltonnal nehezebb; gyakran látható vállként a fő csúcson.
• Methionine oxidation. A metionin maradék ként oxigént vett fel (metionin-szulfoxid, +16 Da). Korábban eluálódik. A Semax metionint tartalmaz, ezért lezártan és hidegen szállítjuk.
• Aspartimide formation and racemization. Átrendeződések aszpartát maradékoknál a szintézis során; kisebb jelentőségű, de jellemző.
• Dimers and aggregates. Két lánc kapcsolódik, általában ciszteinen keresztül; sokkal későbbi eluálás, és MS-en kétszeres tömeg.

Az a laboratórium, amely ezeket a csúcsokat név szerint, vagy legalább retenciós idő és terület szerint jelenti, az integrációját mutatja. Az, amelyik egyetlen számot mutat, nem.

A kifejezés ezernyi listán szerepel. Szó szerint olvasva specifikáció — „legalább 98 %-ot szándékozunk” —, nem pedig egyetlen lot mérése.

Nyom, módszer és lot-szám nélkül nem ellenőrizhető, és egy ellenőrizhetetlen értéknek ugyanannyi az információtartalma, mint a semminek.

Ugyanez vonatkozik a tizedesjegy nélküli százalékokra egy szállító minden termékénél.

A mért értékek 98,7 % vagy 99,31 % lesznek; egy katalógus, ahol minden tétel „99 %”-ot mutat, gépelt, nem tesztelt.

A szállító-ellenőrzésekről, amelyek ebből következnek, a hol vásároljunk kutatási peptideket az USA-ban című bejegyzésben olvasható.

Olyan eset, amikor a tömegvonal, nem pedig a százalék az egész azonosság-ellenőrzés, a GHK‑Cu vs AHK‑Cu bejegyzésben van kidolgozva, két vegyület 14 Da különbséggel.

Egyetlen vegyület tanúsítványának kidolgozott példája — méretek, lot, mit mutat a jelentés — a BPC‑157 vásárlási útmutatóban található.