Peptidien puhtaus: mitä "99 %" HPLC todistuksella tarkoittaa — ja mitä se ei

HPLC — korkean suorituskyvyn nestekromatografia — erottaa näytteen komponentit työntämällä siitä valmistetun liuoksen täytetyn kolonnin läpi paineen alaisena.

Käänteisfaasissa HPLC:ssä, joka on peptidien standardi, kolonnin täyte on pooliton (tyypillisesti C18-ketjuja sidottuna piidioksidiin) ja liikkuva faasi on vettä, jossa on kasvava osuus asetonitriiliä, yleensä 0,1 % trifluorietikkahappoa.

Komponentit poistuvat kolonnista eri aikoina riippuen siitä, kuinka voimakkaasti ne tarttuvat täytteeseen: hydrofobisemmat myöhemmin.

Poistoaukossa UV-detektori tallentaa absorbanssin ajan funktiona. Peptidit absorboivat 214–220 nm:ssä peptidisidostensa vuoksi, joten sitä aallonpituutta käytetään.

Tallenne on kromatogrammi: perusviiva huipuilla, jokainen huippu yksi komponentti, sen ala suhteessa siihen, kuinka paljon kyseistä komponenttia kulki detektorin ohi.

Puhtausluku on alojen suhde:

puhtaus (%) = päähuipun ala ÷ kaikkien huippujen alojen summa × 100

Jos päähuippu kattaa 99,2 % kokonaisintegroidusta alasta, todistuksessa lukee 99,2 %.

Kaikki muu piirroksessa — 0,8 % — on epäpuhtauspiikkejä: muita molekyylejä, jotka absorboivat samalla aallonpituudella ja eluoituivat muina aikoina.

Kolme yksityiskohtaa ratkaisevat, onko luku arvokas: laboratorio ilmoitti menetelmän (kolonni, gradientti, aallonpituus), kromatogrammi näkyy akseineen, ja integrointi on näkyvissä — mitkä huiput laskettiin.

Pelkkänä painettuna prosentti ilman piirrosta on väite, ei mittaus.

USP:n yleinen kromatografiaa koskeva luku kuvaa, mitä raportoitava menetelmä sisältää; vakava todistus noudattaa sitä. Miten asiakirjan loppuosa luetaan, kerrotaan artikkelissa miten peptidien COA luetaan.

Se tarkoittaa: UV-absorboivasta materiaalista, joka tuli ulos kolonnista, 99 % eluoitui yhtenä piikkinä. Näyte on kromatografisesti puhdas.

Se ei tarkoita:

• Ettö fiola sisältää 99 mg peptidiä per 100 mg jauhetta. Lyofilisoidussa peptidissä ei koskaan ole puhdasta peptidiä massan perusteella. Se sisältää jäännösvesiä (muutama prosentti), vastaioneja puhdistuksesta — asetaattia tai trifluoriasetaattia sitoutuneena emäksisiin tähteisiin — ja joskus suoloja. Mikään näistä ei absorboi 220 nm:ssä, joten mikään ei näy kromatogrammissa. Todellisen peptidin massafraction on erillinen mittaus nimeltä nettopeptidipitoisuus, joka saadaan aminohappoanalyysillä tai alkuaineanalyysillä (typpi), ja se on yleensä 70–90 %:n välillä lyofilisoiduissa peptideissä. 99 %:n HPLC-luku ja 80 %:n nettopeptidipitoisuus kuvaavat samaa fiolaa ilman ristiriitaa.
• Ettö pääpiikki on etiketissä mainittu yhdiste. Väärä sekvenssi, hyvin puhdistettuna, antaa myös yhden puhtaan piikin. Identiteetti on eri kysymys, johon vastaa massaspektrometria.
• Mitään erää, jota pidät hallussasi, ellei todistus sisällä kyseisen erän numeroa.

Massaspektrometria punnitsee molekyylin.

Näyte ionisoidaan (elektrospray, ESI, tai MALDI), ja laite ilmoittaa ionien massa-varaus-suhteen; siitä laboratorio laskee havaitun molekyylimassan ja vertaa sitä yhdisteen teoreettiseen massaan.

GHK‑Cu:n odotettu massa on noin 404 Da; BPC‑157:n noin 1 419 Da. Yhteneväisyys daltonin murto-osan sisällä vahvistaa, että pää-HPLC-huippu on etiketissä mainittu peptidi.

HPLC ilman MS:ää antaa puhtauden tunnistamattomalle aineelle; MS ilman HPLC:tä antaa identiteetin ilman puhtauslukua. Analyysitodistus sisältää molemmat rivit, samasta näytteestä, samassa raportissa.

Pienet piikit päähuipun ympärillä eivät ole arvoituksellisia. Kiinteäfaasisynteesi ja sitä seuraava käsittely tuottavat ennustettavan joukon sivutuotteita, ja jokaisella on kemiallinen nimi:

• Typistetyt sekvenssit. Aminohappo ei onnistunut kytkeytymään synteesin aikana, joten osa ketjuista puuttuu yksi aminohappo (deleetio-sekvenssit). Ne eluoituvat lähellä päähuippua ja ovat yleisin epäpuhtaus.
• Epätäydellisesti deprotektioidut ketjut. Suojaryhmä synteesistä (t-butyyli, trityyli) jäi kiinni. Hieman hydrofobisempi: eluoituu myöhemmin.
• Deamidaatio. Asparagiinin tai glutamiinin sivuketjun amidi muuttui karboksyylihapoksi. Yksi dalton raskaampi; usein näkyy olkapäänä päähuipussa.
• Metioniinin hapettuminen. Metioniinitähteen rikki otti hapen (metioniinisulfoksidi, +16 Da). Eluoituu aikaisemmin. Semax sisältää metioniinia, minkä vuoksi se toimitetaan suljettuna ja kylmänä.
• Aspartimidin muodostuminen ja raseemisaatio. Aspartaattitähteiden uudelleenjärjestymät synteesin aikana; vähäisiä, mutta tyypillisiä.
• Dimeerit ja aggregaatit. Kaksi ketjua linkittyneenä, yleensä kysteiinin kautta; paljon myöhempi eluutio ja kaksinkertainen massa MS:ssä.

Laboratorio, joka ilmoittaa nämä piikit nimellä tai ainakin retentioajalla ja alalla, näyttää integrointinsa. Yksi luku vain ei näytä sitä.

Lause esiintyy tuhansissa listauksissa. Kirjaimellisesti luettuna se on spesifikaatio — "tarkoitamme vähintään 98 %" — ei minkään erän mittaus.

Ilman piirrosta, menetelmää ja eränumeroa sitä ei voi tarkistaa, ja lukua, jota ei voi tarkistaa, on yhtä informatiivinen kuin ei lukua lainkaan.

Sama koskee prosentteja, joissa ei ole desimaalia jokaiselle toimittajan tuotteelle.

Mitatut arvot ovat 98,7 % tai 99,31 %; luettelossa, jossa jokainen kohta lukee "99 %", on kirjoitettu, ei testattu.

Toimittajan tarkistukset, jotka tästä seuraavat, käsitellään artikkelissa miten ostaa tutkimuspeptidejä Yhdysvalloissa.

Tapaus, jossa massarivi eikä prosentti on koko identiteettitarkistus, käydään läpi artikkelissa GHK‑Cu vs AHK‑Cu, kaksi yhdistettä 14 Da:n päässä toisistaan.

Yksittäisen yhdisteen sertifikaatin esimerkki — koot, erä, mitä raportti näyttää — on BPC‑157 ostooppaassa.