Čistost peptidov: kaj pomeni "99 %" HPLC na certifikatu — in kaj ne

HPLC — tekočinska kromatografija visoke ločljivosti — loči komponente vzorca tako, da raztopino potiska skozi napolnjeno kolono pod tlakom.

V HPLC v reverzni fazi, standardu za peptide, je polnilo kolone nepolarno (običajno verige C18 vezane na silicijev dioksid) in mobilna faza je voda z naraščajočim deležem acetonitrila, običajno z 0,1 % trifluoroocetne kisline.

Komponente zapustijo kolono ob različnih časih glede na to, kako močno se oprimejo polnila: bolj hidrofobne, kasneje.

Na izhodu UV detektor beleži absorbanco glede na čas. Peptidi absorbirajo pri 214–220 nm zaradi peptidnih vezi, zato se uporablja ta valovna dolžina.

Zapis je kromatogram: osnovna črta z vrhovi, vsak vrh ena komponenta, njegova površina sorazmerna s količino te komponente, ki je prešla detektor.

Številka čistosti je razmerje površin:

čistost (%) = površina glavnega vrha ÷ vsota površin vseh vrhov × 100

Če glavni vrh predstavlja 99,2 % celotne integrirane površine, certifikat prikaže 99,2 %. Vse drugo v zapisu — 0,8 % — so vrhovi nečistoč: druge molekule, ki absorbirajo pri isti valovni dolžini in so eluirale ob drugih časih.

Tri podrobnosti določajo, ali je ta številka vredna: laboratorij je navedel metodo (kolona, gradient, valovna dolžina), prikazan je kromatogram z osmi in integracija je vidna — kateri vrhovi so bili šteti.

Odstotek, natisnjen samostojno, brez zapisa, je trditev, ne meritev. Splošno poglavje USP o kromatografiji opisuje, kaj vključuje poročljiva metoda; resen certifikat jo upošteva.

Kako prebrati preostanek dokumenta je v kako prebrati COA peptida.

Pove: od UV-absorbirajočega materiala, ki je prišel iz kolone, je 99 % eluiralo kot en sam vrh. Vzorec je kromatografsko čist.

Ne pove:

• Da vial vsebuje 99 mg peptida na 100 mg praška. Liofiliziran peptid nikoli ni čisti peptid po masi. Vsebuje preostalo vodo (nekaj odstotkov), protiione iz čiščenja — acetat ali trifluoroacetat vezan na bazične ostanke — in včasih soli. Nobena od teh ne absorbira pri 220 nm, zato se ne pojavijo v kromatogramu. Masni delež dejanskega peptida je ločena meritev, imenovana neto vsebnost peptida, pridobljena z analizo aminokislin ali elementarno (dušikovo) analizo, in običajno znaša med 70 in 90 % za liofilizirane peptide. 99 % HPLC in 80 % neto vsebnost peptida opisujeta isto vial brez protislovja.
• Da je glavni vrh spojina na nalepki. Napačno zaporedje, dobro prečiščeno, prav tako daje en čist vrh. Identiteta je drugo vprašanje, na katerega odgovori masna spektrometrija.
• Karkoli o lotu, ki ga imate, razen če certifikat nosi številko tega lota.

Masna spektrometrija pretehta molekulo.

Vzorec se ionizira (elektrosprej, ESI, ali MALDI), instrument pa poroča razmerje masa-naboj ionov; iz tega laboratorij izračuna opaženo molekulsko maso in jo primerja s teoretično maso spojine.

Za GHK‑Cu je pričakovana masa približno 404 Da; za BPC‑157 približno 1.419 Da. Ujemanje v delčku daltona potrdi, da je glavni HPLC vrh peptid, imenovan na nalepki.

HPLC brez MS daje čistost neidentificirane snovi; MS brez HPLC daje identiteto brez številke čistosti. Certifikat analize vsebuje obe vrstici, iz istega vzorca, na istem poročilu.

Majhni vrhovi okoli glavnega niso skrivnostni. Sinteza peptidov v trdni fazi in nadaljnje ravnanje proizvedeta predvidljiv niz stranskih produktov, vsak ima kemijsko ime:

• Okrajšana zaporedja. Ostanek se med sintezo ni vezal, zato je del verig brez ene aminokisline (delecijska zaporedja). Eluirajo blizu glavnega vrha in so najpogostejša nečistoča.
• Nepopolnoma dezaščitene verige. Zaščitna skupina iz sinteze (t-butil, trityl) je ostala pritrjena. Rahlo bolj hidrofobno: eluira kasneje.
• Deamidacija. Amid stranske verige asparagina ali glutamina se pretvori v karboksilno kislino. Težji za en dalton; pogosto viden kot ramo na glavnem vrhu.
• Oksidacija metionina. Žveplo ostanka metionina je prevzelo kisik (metionin sulfoksid, +16 Da). Eluira prej. Semax vsebuje metionin, zato se pošilja zapečateno in hladno.
• Formacija aspartimida in racemizacija. Preureditve pri aspartatnih ostankih med sintezo; manjše, a značilne.
• Dimers in agregati. Dve verigi povezani, običajno prek cisteina; veliko kasnejša elucija in podvojena masa na MS.

Laboratorij, ki te vrhove poroča po imenu ali vsaj po retencijskem času in površini, kaže svojo integracijo. Tisti, ki prikaže samo številko, ne.

Stavek se pojavi na tisočih oglasov. Dobesedno prebran je specifikacija — "namenjamo vsaj 98 %" — ne meritev katerega koli lota.

Brez zapisa, metode in številke lota ga ni mogoče preveriti, številka, ki je ni mogoče preveriti, pa ima enako informacijsko vrednost kot nobena številka.

Enako velja za odstotke brez decimalnega mesta pri vsakem izdelku dobavitelja. Izmerjene vrednosti izpadejo kot 98,7 % ali 99,31 %; katalog, kjer vsak izdelek bere "99 %", je bil natipkan, ne testiran.

Preverjanja dobaviteljev, ki sledijo iz tega, so v kje kupiti raziskovalne peptide v ZDA. Primer, kjer je masna vrstica in ne odstotek celotno preverjanje identitete, je obdelan v GHK‑Cu proti AHK‑Cu, dve spojini 14 Da narazen.

Delovni primer certifikata za eno spojino — velikosti, lot, kaj poročilo kaže — je v vodniku za nakup BPC‑157.