Purità tal-peptidi: x'jfisser "99 %" HPLC fuq ċertifikat — u x'ma jfissirx

HPLC — kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja — tissepara l-komponenti ta' kampjun billi timbotta soluzzjoni tiegħu minn kolonna mimlija taħt pressjoni.

F'HPLC b'inversja ta' fażi, l-istandard għall-peptidi, il-mili tal-kolonna huwa mhux polari (tipikament ktajjen C18 marbuta ma' silika) u l-fażi mobbli hija ilma b'żieda ta' aċetonitrile, normalment b'0.1 % aċidu trifluooraċetiku.

Il-komponenti joħorġu mill-kolonna f'ħinijiet differenti skont kemm jaderixxu mal-mili: aktar idrofobiċi, aktar tard.

Fil-ħruġ, detettur UV jirreġistra l-assorbiment kontra ż-żmien. Il-peptidi jassorbu f'214–220 nm minħabba r-rabtiet peptidiċi tagħhom, u għalhekk dik hija t-tul ta' mewġa użata.

Ir-reġistrazzjoni hija l-kromatogramma: linja bażi b'quċċati, kull quċċata komponent wieħed, iż-żona tagħha proporzjonali għall-kwantità ta' dak il-komponent li għadda mid-dettettur.

Iċ-ċifra tal-purità hija proporzjon ta' żoni:

purità (%) = żona tal-quċċata prinċipali ÷ somma taż-żoni tal-quċċati kollha × 100

Jekk il-quċċata prinċipali tammonta għal 99.2 % taż-żona integrata totali, iċ-ċertifikat juri 99.2 %.

Kollox ieħor fit-traċċa — l-0.8 % — huma quċċati ta' impuritajiet: molekuli oħra li jassorbu fl-istess tul ta' mewġa u ħarġu f'ħinijiet oħra.

Tliet dettalji jiddeterminaw jekk dik iċ-ċifra tiswa xejn: il-laboratorju rrapporta l-metodu (kolonna, gradjent, tul ta' mewġa), il-kromatogramma tintwera bl-assi tagħha, u l-integrazzjoni tidher — liema quċċati ġew magħduda.

Persentaġġ stampat waħdu, mingħajr traċċa, huwa talba, mhux kejl.

Il-kapitolu ġenerali USP dwar il-kromatografija jiddeskrivi x'jinkludi rapport metodiku; ċertifikat serju jsegwih. Kif taqra l-bqija tad-dokument jinsab f'kif taqra ċertifikat ta' peptidi.

Jgħid: mill-materjal li jassorbi UV li ħareġ mill-kolonna, 99 % ħareġ bħala quċċata waħda. Il-kampjun huwa nadif kromatografikament.

Mhuwiex jgħid:

• Li l-vjal fih 99 mg ta' peptidi għal kull 100 mg ta' trab. Peptidi liofilizzati qatt mhumiex peptidi puri bil-massa. Iġorru ilma residwu (ftit fil-mija), joni kontrarji li jibqgħu mill-purifikazzjoni — aċetat jew trifluooraċetat marbut mar-residwi bażiċi — u kultant melħ. Xejn minn dawn ma jassorbi f'220 nm, għalhekk xejn ma jidher fil-kromatogramma. Il-frazzjoni tal-massa tal-peptidi attwali hija kejl separat imsejjaħ kontenut nett tal-peptidi, miksub b'analiżi ta' aċidi amminiċi jew analiżi elementari (nitroġenu), u normalment ikun bejn 70 u 90 % għall-peptidi liofilizzati. Ċifra HPLC ta' 99 % u kontenut nett ta' 80 % jiddeskrivu l-istess vjal mingħajr kontradizzjoni.
• Li l-quċċata prinċipali hija l-kompost fuq it-tikketta. Sekwenza ħażina, purifikata tajjeb, tagħti wkoll quċċata nadifa waħda. L-identità hija mistoqsija differenti, imwieġba bl-ispettrometrija tal-massa.
• Xejn dwar il-lott li għandek, sakemm iċ-ċertifikat iġorr in-numru ta' dak il-lott.

L-ispettrometrija tal-massa tiżen il-molekula.

Il-kampjun jiġi jonizzat (elettrosprej, ESI, jew MALDI), u l-istrument jirrapporta l-proporzjon massa-to-charge tal-joni; minnu l-laboratorju jikkalkula l-massa molekulari osservata u jqabbilha mal-massa teoretika tal-kompost.

Għal GHK‑Cu il-massa mistennija hija madwar 404 Da; għal BPC‑157, madwar 1,419 Da. Qbil f'frazzjoni ta' dalton jikkonferma li l-quċċata prinċipali HPLC hija l-peptidi msemmija fuq it-tikketta.

HPLC mingħajr MS jagħti purità ta' sustanza mhux identifikata; MS mingħajr HPLC jagħti identità mingħajr ċifra ta' purità. Ċertifikat ta' analiżi jġorr iż-żewġ linji, mill-istess kampjun, fuq l-istess rapport.

Il-quċċati żgħar madwar il-prinċipali mhumiex misterjużi. Is-sintesi ta' peptidi f'fażi solida u l-immaniġġjar li jsegwi jipproduċu sett prevedibbli ta' prodotti sekondarji, u kull wieħed għandu isem kimiku:

• Sekwenzi mqassra. Residwu naqas milli jgħaqqad waqt is-sintesi, għalhekk frazzjoni ta' ktajjen huma nieqsa minn aċidu amminiku wieħed (sekwenzi ta' tħassir). Joħorġu qrib il-quċċata prinċipali u huma l-impurità l-aktar komuni.
• Ktajjen mhux protetti kompletament. Grupp protettiv mis-sintesi (t-butyl, trityl) baqa' mwaħħal. Aktar idrofobiku ftit: joħroġ aktar tard.
• Deamidazzjoni. Amide tal-katina laterali ta' asparagine jew glutamine nbidlet f'aċidu karbossiliku. Wieħed dalton itqal; spiss tidher bħala spalla fuq il-quċċata prinċipali.
• Ossidazzjoni tal-metjonina. Il-kubrit ta' residwu ta' metjonina ħa ossiġnu (metjonina sulfossidu, +16 Da). Joħroġ aktar kmieni. Semax fih metjonina, u għalhekk jintbagħat issiġillat u kiesaħ.
• Formazzjoni ta' aspartimide u raċemizzazzjoni. Riarranġamenti f'residwi ta' aspartate waqt is-sintesi; minuri, iżda karatteristiċi.
• Dimeri u aggregati. Żewġ ktajjen marbuta, normalment permezz ta' ċisteina; ħruġ ferm aktar tard, u massa rduppjata fuq MS.

Laboratorju li jirrapporta dawn il-quċċati bl-isem, jew mill-inqas biż-żmien ta' ritenzjoni u ż-żona, qed juri l-integrazzjoni tiegħu. Wieħed li juri numru wieħed biss mhuwa.

Il-frażi tidher fuq eluf ta' elenkarji. Jekk tinqara litteralment hija speċifikazzjoni — "aħna nippjanaw mill-inqas 98 %" — mhux kejl ta' xi lott.

Mingħajr traċċa, metodu u numru ta' lott, ma tistax tiġi ċċekkjata, u ċifra li ma tistax tiġi ċċekkjata għandha l-istess kontenut ta' informazzjoni bħal ebda ċifra.

L-istess japplika għal persentaġġi mogħtija mingħajr post deċimali fuq kull prodott ta' fornitur.

Valuri mkejla joħorġu bħala 98.7 % jew 99.31 %; katalogu fejn kull oġġett jaqra "99 %" ġie ttippjat, mhux ittestjat.

Kontrolli tal-fornituri li jsegwu minn dan jinsabu f'fejn tixtri peptidi ta' riċerka fl-Istati Uniti.

Każ fejn il-linja tal-massa, u mhux il-persentaġġ, hija l-kontroll kollu tal-identità huwa analizzat f'GHK‑Cu vs AHK‑Cu, żewġ komposti 14 Da 'l bogħod.

Eżempju maħdum ta' ċertifikat għal kompost wieħed — daqsijiet, lott, x'juri r-rapport — jinsab f'gwida tax-xiri ta' BPC‑157.