Peptidų grynumas: ką reiškia „99 %“ HPLC sertifikate — ir ko tai nereiškia

HPLC — didelio efektyvumo skysčių chromatografija — atskiria mėginio komponentus, praleidžiant jo tirpalą per pripildytą kolonėlę esant slėgiui.

Atvirkštinės fazės HPLC, standarte peptidams, kolonėlės užpildas yra nepolinis (paprastai C18 grandinės, prijungtos prie silicio dioksido), o judrioji fazė — vanduo su didėjančia acetonitrilo dalimi, paprastai su 0,1 % trifluoracto rūgšties.

Komponentai palieka kolonėlę skirtingu laiku, priklausomai nuo to, kaip stipriai jie prilimpa prie užpildo: hidrofobiškesni — vėliau.

Išėjime UV detektorius registruoja absorbciją laiko atžvilgiu.

Peptidai sugeria 214–220 nm bangos ilgyje dėl peptidinių ryšių, todėl naudojamas šis bangos ilgis. Įrašas yra chromatograma: bazinė linija su smailėmis, kiekviena smailė — vienas komponentas, jos plotas proporcingas tam, kiek to komponento praėjo pro detektorių.

Grynumo rodiklis yra plotų santykis:

grynumas (%) = pagrindinės smailės plotas ÷ visų smailių plotų suma × 100

Jei pagrindinė smailė sudaro 99,2 % viso integruoto ploto, sertifikate rašoma 99,2 %. Visa kita chromatogramoje — 0,8 % — yra priemaišų smailės: kitos molekulės, kurios sugeria tą pačią bangos ilgį ir išėjo kitu laiku.

Trys detalės lemia, ar tas skaičius vertingas: laboratorija nurodė metodą (kolonėlė, gradientas, bangos ilgis), parodyta chromatograma su ašimis ir matoma integracija — kurios smailės buvo skaičiuojamos.

Procentas, atspausdintas atskirai, be chromatogramos, yra teiginys, o ne matavimas.

Bendras USP chromatografijos skyrius aprašo, ką turi apimti ataskaitinis metodas; rimtas sertifikatas jo laikosi. Kaip skaityti likusią dokumento dalį — kaip skaityti peptidų COA.

Sako: iš UV sugeriančios medžiagos, išėjusios iš kolonėlės, 99 % išėjo kaip viena smailė. Mėginys chromatografiškai švarus.

Nesako:

• Kad buteliuke yra 99 mg peptido 100 mg miltelių. Liofilizuotas peptidas niekada nėra grynas peptidas pagal masę. Jame yra likutinio vandens (keli procentai), priešjonų, likusių po valymo — acetato ar trifluoracetato, susijungusio su bazinėmis liekanomis — ir kartais druskų. Nė viena iš jų nesugeria 220 nm, todėl chromatogramoje nematomos. Tikrojo peptido masės dalis yra atskiras matavimas, vadinamas grynu peptido kiekiu, gaunamas aminorūgščių analize arba elementine (azoto) analize, ir liofilizuotiems peptidams paprastai yra tarp 70 ir 90 %. 99 % HPLC rodiklis ir 80 % gryno peptido kiekis apibūdina tą patį buteliuką be prieštaravimo.
• Kad pagrindinė smailė yra etiketėje nurodytas junginys. Neteisinga seka, gerai išvalyta, taip pat duoda vieną švarią smailę. Tapatybė yra kitas klausimas, atsakomas masių spektrometrija.
• Nieko apie partiją, kurią turite, nebent sertifikate yra tos partijos numeris.

Masių spektrometrija sveria molekulę.

Mėginys jonizuojamas (elektrosprejumi, ESI, arba MALDI), o prietaisas pateikia jonų masės ir krūvio santykį; iš jo laboratorija apskaičiuoja stebimą molekulinę masę ir palygina ją su teorine junginio mase.

GHK‑Cu tikėtina masė yra apie 404 Da; BPC‑157 — apie 1 419 Da. Sutapimas per dalį daltono patvirtina, kad pagrindinė HPLC smailė yra etiketėje nurodytas peptidas.

HPLC be MS duoda neidentifikuotos medžiagos grynumą; MS be HPLC duoda tapatybę be grynumo rodiklio. Analizės sertifikate yra abi eilutės, iš to paties mėginio, toje pačioje ataskaitoje.

Mažos smailės aplink pagrindinę nėra paslaptingos. Kietosios fazės peptidų sintezė ir tolesnis apdorojimas sukuria nuspėjamą šalutinių produktų rinkinį, ir kiekvienas turi cheminį pavadinimą:

• Sutrumpintos sekos. Sintezės metu nepavyko prijungti vienos liekanos, todėl dalis grandinių neturi vienos aminorūgšties (delecijos sekos). Jos išeina arti pagrindinės smailės ir yra dažniausia priemaiša.
• Nevisiškai deproteguotos grandinės. Sintezės metu apsauginė grupė (t-butilas, tritiilas) liko prijungta. Šiek tiek hidrofobiškesnė: išeina vėliau.
• Deamidacija. Asparagino arba glutamino šalutinės grandinės amidas virto karboksirūgštimi. Viena daltonu sunkesnė; dažnai matoma kaip petys ant pagrindinės smailės.
• Metionino oksidacija. Metionino liekanos siera prisijungė deguonį (metionino sulfoksidas, +16 Da). Išeina anksčiau. Semax turi metionino, todėl jis siunčiamas uždarytas ir šaltas.
• Aspartimido susidarymas ir racemizacija. Persitvarkymai aspartato liekanose sintezės metu; nedideli, bet būdingi.
• Dimerai ir agregatai. Dvi grandinės susijungusios, paprastai per cisteiną; išeina daug vėliau, o MS rodo dvigubą masę.

Laboratorija, kuri nurodo šias smailes pavadinimu arba bent jau sulaikymo laiku ir plotu, rodo savo integraciją. Ta, kuri rodo tik vieną skaičių, to nedaro.

Frazė pasirodo tūkstančiuose sąrašų. Pažodžiui perskaičius tai yra specifikacija — „ketiname bent 98 %“ — o ne kurios nors partijos matavimas.

Be chromatogramos, metodo ir partijos numerio jo negalima patikrinti, o skaičius, kurio negalima patikrinti, turi tokią pat informacijos vertę kaip ir jokio skaičiaus.

Tas pats galioja procentams, pateiktiems be kablelio kiekvienam tiekėjo produktui. Išmatuotos vertės būna 98,7 % arba 99,31 %; katalogas, kuriame kiekvienas punktas rodo „99 %“, buvo surinktas, o ne ištirtas.

Tiekėjo patikrinimai, kylantys iš to, yra kur pirkti tyrimų peptidus JAV. Atvejis, kai masės linija, o ne procentas, yra visas tapatybės patikrinimas, nagrinėjamas GHK‑Cu vs AHK‑Cu, dviejuose junginiuose, skiriančiuose 14 Da.

Išsamus vieno junginio sertifikato pavyzdys — dydžiai, partija, ką rodo ataskaita — yra BPC‑157 pirkimo vadove.