Peptiidi puhtus: mida tähendab "99 %" HPLC sertifikaadil — ja mida see ei tähenda

HPLC — kõrgsurvevedelikkromatograafia — eraldab proovi komponendid, surudes selle lahuse läbi täidetud kolonni rõhu all.

Pöördfaasi HPLC-s, mis on peptiidide standard, on kolonni täidis mittepolaarne (tavaliselt ränidioksiidile seotud C18 ahelad) ja mobiilne faas on vesi koos kasvava atsetonitriili osakaaluga, tavaliselt 0,1 % trifluoroäädikhappega.

Komponendid lahkuvad kolonnist eri aegadel sõltuvalt sellest, kui tugevalt nad täidisele kinnituvad: hüdrofoobsemad hiljem.

Väljundis registreerib UV-detektor neeldumist aja suhtes. Peptiidid neelavad 214–220 nm juures peptiidsidemete tõttu, seega kasutatakse seda lainepikkust.

Salvestis on kromatogramm: baasjoon piikidega, iga piik üks komponent, selle pindala proportsionaalne selle komponendi kogusega, mis detektorist läbi läks.

Puhtuse näitaja on pindalade suhe:

puhtus (%) = peapiigi pindala ÷ kõigi piikide pindalade summa × 100

Kui peapiik moodustab 99,2 % kogu integreeritud pindalast, näitab sertifikaat 99,2 %. Kõik muu jäljel — 0,8 % — on lisandite piigid: teised molekulid, mis neelavad samal lainepikkusel ja elueerusid teistel aegadel.

Kolm detaili määravad, kas see number on väärtuslik: labor teatas meetodist (kolonn, gradient, lainepikkus), kromatogramm on näidatud telgedega ja integreerimine on nähtav — millised piigid loeti. Üksinda trükitud protsent ilma jäljeta on väide, mitte mõõtmine. Üldine USP peatükk kromatograafia kohta kirjeldab, mida aruandekõlbulik meetod sisaldab; tõsine sertifikaat järgib seda.

Kuidas ülejäänud dokumenti lugeda, on lehel kuidas lugeda peptiidi COA-d.

Ütleb: UV-kiirgust neelavast materjalist, mis kolonnist välja tuli, 99 % elueerus ühe piigina. Proov on kromatograafiliselt puhas.

Ei ütle:

• Et viaal sisaldab 99 mg peptiidi 100 mg pulbri kohta. Lüofiliseeritud peptiid ei ole massi järgi kunagi puhas peptiid. See sisaldab jääkvesi (mõni protsent), vastasioone puhastamisest — atsetaat või trifluoroatsetaat seotud aluseliste jääkidega — ja mõnikord sooli. Ükski neist ei neela 220 nm juures, seega ei ilmu kromatogrammile. Tegeliku peptiidi massiosa on eraldi mõõtmine nimega netopeptiidi sisaldus, saadud aminohappeanalüüsiga või elementanalüüsiga (lämmastik), ja see on lüofiliseeritud peptiidide puhul tavaliselt 70–90 % vahel. 99 % HPLC näitaja ja 80 % netopeptiidi sisaldus kirjeldavad sama viaali ilma vastuoluta.
• Et peapiik on etiketil olev ühend. Vale järjestus, hästi puhastatud, annab samuti ühe puhta piigi. Identiteet on teine küsimus, millele vastab massispektromeetria.
• Midagi teie käes oleva partii kohta, kui sertifikaat ei kanna selle partii numbrit.

Massispektromeetria kaalub molekuli.

Proov ioniseeritakse (elektropihusti, ESI, või MALDI) ja seade annab ioonide mass-laengu suhte; sellest arvutab labor vaadeldud molekulmassi ja võrdleb seda ühendi teoreetilise massiga.

GHK‑Cu puhul on oodatav mass umbes 404 Da; BPC‑157 puhul umbes 1 419 Da. Nõustumine murdosa daltoni piires kinnitab, et peamine HPLC piik on etiketil nimetatud peptiid.

HPLC ilma MS-ita annab tuvastamata aine puhtuse; MS ilma HPLC-ta annab identiteedi ilma puhtuse näitajata. Analüüsisertifikaat sisaldab mõlemat rida, samast proovist, samal aruandel.

Väikesed piigid peapiigi ümber ei ole müstilised. Tahkefaasilise peptiidisünteesi ja sellele järgnev käitlemine tekitavad ennustatava kõrvalsaaduste komplekti, ja igal neist on keemiline nimi:

• Lühendatud järjestused. Üks jääk ei ühinenud sünteesi ajal, seega on osa ahelaid ühe aminohappe võrra lühemad (deletsioonijärjestused). Nad elueeruvad peapiigi lähedal ja on kõige tavalisem lisand.
• Mittetäielikult deprotekteeritud ahelad. Sünteesist pärit kaitserühm (t-butüül, trityül) jäi kinnitunuks. Veidi hüdrofoobsem: elueerub hiljem.
• Deamideerimine. Asparagiini või glutamiini kõrvalahela amiid muutus karboksüülhappeks. Üks dalton raskem; sageli nähtav peapiigi õlana.
• Metioniini oksüdeerumine. Metioniini jäägi väävel haaras hapniku (metioniinsulfoksiid, +16 Da). Elueerub varem. Semax sisaldab metioniini, mistõttu see saadetakse suletuna ja külmas.
• Aspartiimiidi moodustumine ja ratsemiseerumine. Ümberkorraldused aspartaadi jääkides sünteesi ajal; väiksemad, kuid iseloomulikud.
• Dimmeerid ja agregaadid. Kaks ahelat seotud, tavaliselt tsüsteiini kaudu; palju hilisem elueerumine ja kahekordne mass MS-il.

Labor, mis nimetab need piigid nime või vähemalt retentsiooniaja ja pindala järgi, näitab oma integreerimist. Üks, mis näitab ainult ühte numbrit, ei näita.

Fraas ilmub tuhandetel loenditel. Sõna-sõnalt on see spetsifikatsioon — "me kavatseme vähemalt 98 %" — mitte ühegi partii mõõtmine.

Ilma jäljeta, meetodita ja partii numbrita ei saa seda kontrollida, ja näitajat, mida ei saa kontrollida, on sama informatiivne kui üldse mitte näitajat.

Sama kehtib protsentide kohta, mis on antud ilma kümnendkohata iga tarnija iga toote kohta. Mõõdetud väärtused tulevad 98,7 % või 99,31 %; kataloog, kus iga kirje ütleb "99 %", on trükitud, mitte testitud.

Tarnija kontrollid, mis sellest tulenevad, on lehel kust osta uurimispeptiide USAs. Juhtum, kus massirida, mitte protsent, on kogu identiteedikontroll, on läbi töötatud lehel GHK‑Cu vs AHK‑Cu, kaks ühendit 14 Da vahega.

Ühe ühendi sertifikaadi töönäide — suurused, partii, mida aruanne näitab — on lehel BPC‑157 ostujuhend.